Investigadores del CIBERES -pertenecientes al grupo coordinado por Patricia Muñoz en el Hospital Gregorio Marañón de Madrid- han desarrollado un estudio para la detección de variantes minoritarias e infecciones mixtas en Mycobacterium tuberculosis (MTB) mediante secuenciación directa del genoma completo en muestras no cultivadas mediante una estrategia de captura de ADN específico.
La detección precoz de infecciones mixtas en MTB se considera, cada vez más, un aspecto clave en el diagnóstico, ya que, puede afectar a la evolución del paciente y a la administración del tratamiento más adecuado para la recuperación.
Se considera infección mixta cuando coexisten de forma simultánea 2 cepas diferentes de MTB o 2 variantes distintas de la misma cepa (una evolucionada de la otra, por ejemplo, mediante la adquisición de mutaciones de resistencia). La identificación de estas infecciones mixtas es especialmente relevante cuando una de las poblaciones presenta resistencia a alguno de los fármacos más efectivos para el tratamiento (rifampicina e isoniacida); esta situación de coexistencia de bacterias con diferente perfil de resistencia se conoce como heterorresistencia. Si la población resistente es minoritaria, muy probablemente no pueda ser detectada por los métodos moleculares ni fenotípicos que se utilizan habitualmente en los laboratorios de diagnóstico y el paciente recibirá el tratamiento convencional, de este modo, se favorecerá el crecimiento de la población resistente en detrimento de la población sensible. Como consecuencia, el tratamiento no será efectivo prolongando el tiempo de enfermedad y el período en el que el paciente es infeccioso, empeorará el pronóstico y la evolución de la enfermedad.
El rendimiento de la detección de las infecciones mixtas es superior cuando se realiza sobre la muestra clínica que cuando se lleva a cabo tras el crecimiento en cultivo, puesto que, la capacidad de crecimiento de las cepas con mutaciones de resistencia, en ocasiones, está disminuida y se pueden perder en este proceso de crecimiento. De manera que no se pueden detectar a pesar de estar presentes en la muestra inicial. Por otra parte, teniendo en cuenta que MTB es un microorganismo de crecimiento lento, la detección tras el cultivo retrasa 3 semanas la identificación de la infección mixta y el paciente habrá recibido el tratamiento equivocado durante ese período de tiempo.
La tecnología óptima para la detección de infecciones mixtas es, indudablemente, la secuenciación de genoma completo (WGS), ya que, permite identificar poblaciones minoritarias que presenten únicamente algunas mutaciones puntuales con respecto a la población mayoritaria de la muestra del paciente. La gran limitación de la WGS en este caso, es su ejecución partiendo de la muestra clínica debido a que el contenido mayoritario de DNA en estas muestras está formado por DNA humano procedente de las células del paciente y por DNA procedente de los microorganismos habituales de la flora del tracto respiratorio; siendo minoritario el DNA de MTB, que es el de interés.
De este problema, surge el estudio que los autores presentan en este artículo cuya primera autora es Nuria Lozano y que ha sido coordinado por Laura Pérez García - ambas investigadoras del Hospital Gregorio Marañón de Madrid-. En el estudio se ha diseñado una plataforma de captura de DNA específico de MTB (MycoCap) para enriquecer el DNA de interés en la muestra clínica y, posteriormente, llevar a cabo la WGS del DNA capturado que será mayoritariamente de MTB.
En este trabajo en el que también han colaborado los investigadores del CIBERES Darío García de Viedma, Patricia Muñoz y Marta Herranz se realizó un estudio piloto para evaluar la capacidad de la plataforma MycoCap para capturar el DNA de MTB en condiciones controladas y determinar su utilidad para identificar infecciones mixtas y heterorresistencias en poblaciones minoritarias.
Se prepararon 12 muestras que contenían un 98% de una mezcla de DNAs procedentes de esputos de pacientes sin tuberculosis (DNA humano y DNA de la flora) y un 2% de DNA de MTB formado, a su vez, por mezclas de DNAs a diferentes proporciones (simulando distintas infecciones mixtas). Se llevó a cabo la captura y la WGS; el resultado mostró secuencias de MTB que presentaban la misma calidad que cuando el DNA procede de cultivo, con una cobertura del genoma y una profundidad de lectura óptimas para el análisis. La identificación de las variantes minoritarias se hizo de forma manual y permitió la identificación de poblaciones minoritarias hasta una proporción 95:5. Además, se analizó la capacidad de la estrategia para identificar de forma automática la presencia de infecciones mixtas identificándolas de forma clara cuando en las proporciones 50-50, 80-20 y 90-10.
"Los resultados obtenidos muestran que nuestra estrategia de enriquecimiento del DNA de MTB mediante la plataforma MycoCaP en muestras clínicas, permite llevar a cabo la WGS del DNA de MTB en un fondo genético mayoritariamente inespecífico. Además, el DNA capturado es fielmente representativo de la muestra inicial, ya que, permite identificar poblaciones minoritarias e infecciones mixtas en porcentajes muy bajos (5% y 10%, respectivamente)" comentan los coordinadores del estudio. "Asimismo -aseguran- la utilización de esta estrategia en pacientes con alta sospecha de infección mixta o heterorresistencia, adelantaría enormemente el diagnóstico y la administración del tratamiento más adecuado".
Referencia del artículo:
Detection of Minority Variants and Mixed Infections in Mycobacterium tuberculosis by Direct Whole-Genome Sequencing on Noncultured Specimens Using a Specific-DNA Capture Strategy
mSphere. 2021 Dec 22;6(6):e0074421. doi: 10.1128/mSphere.00744-21
